免疫诊断试剂开发的7个技巧

免疫诊断试剂是广泛应用的一种测试系列，通过抗体-抗原结合来检测特定目标。这可能涉及使用实验性抗体来检测特定蛋白质的存在，也可能使用重组蛋白来检测天然抗体的存在。

在开发、使用免疫诊断试剂或排除故障时，都需要考虑一些共同的影响因素以获得最佳反应体系系统。本文将介绍一些技巧和窍门，以帮助完善免疫诊断试剂并取得最佳测试结果。

1. 主要原料选择

花时间选择一个好的免疫原料会节省大量的检测开发时间，并产生更好质量的免疫诊断试剂。所选择的免疫原料最好是纯的，并且结构上与目标分析物相同。建议尝试多个厂家抗体，这可能包括同一目标的不同表位抗体、多克隆与单克隆抗体、不同宿主物种的抗体，甚至不同供应商提供的抗体。

抗体即使是来自不同批次或供应商的相同抗体，也会在检测效果上表现出固有差异。不同表位的抗体在不同样品类型或条件下结合的可用性也可能不同，所以确保检测方法与实际使用的样品类型相匹配。

2. 其他辅料影响因数

虽然抗原抗体是免疫检测的核心，但实验过程中还涉及一系列其他试剂和材料，这些因素将对检测结果产生重要影响。

以Western blot为例，可以利用多种具有不同特性的膜类型进行印迹。即使选择了一种膜类型，在不同制造商生产的同等膜之间也可能存在性能上的差异，横向流动膜也是如此。在使用塑料器皿固定的免疫诊断试剂如ELISA时，可供选择的材料和表面处理以及结合特性各不相同，这些因素都会影响测定的有效性。因此，在选择合适的试剂时，不要满足于手头的材料，而是尝试不同的选择和不同品牌，并进行平行试验以找到最佳结果的产品。

3. 提供稳定的缓冲液

缓冲液提供了免疫诊断试剂中的反应环境，所以选择合适的缓冲液条件非常重要。除了尝试不同的缓冲溶液外，还需要尝试不同浓度的溶液。

即使是微小的浓度差异也可能导致检测成功或失败。这不仅适用于检测过程本身的缓冲液，也适用于上游过程中使用的缓冲液，如重组蛋白的制备或样品的储存，因为这些缓冲液可能会带入免疫检测中并产生干扰，一定程度上破坏了主要原材料的稳定性。

4. 妥善保管样品

即使掌握了最佳的检测方法，样品质量差或未得到适当保管也可能导致失望的结果。从采集样品开始，就要妥善保管好样本，我们在实际开发过程中，样本往往是医院带回来的，在带回途中必须控制好储存稳定！样本包括血液、血浆、血清、组织、细胞、微生物等，保管得越好，结果就越相关和有意义。

特别是对于临床诊断试剂，保存时间会影响阳性和阴性结果，不论是假阴性还是假阳性结果都是不希望看到的。随着时间推移，蛋白质（包括抗体）会降解，而温度升高、pH值变化、渗透压变化和破坏性化学物质等因素会加速降解。

理想的保管条件主要取决于样品类型，所以做足功课很重要。通常，低温和生物相关的缓冲条件可能是最好的选择。但对某些样品类型可能导致目标蛋白的损伤和降解，反复冻融对大多数样品肯定是有害的，必须要去医院拿新鲜样本测试开发。

5. 彻底清洗反应体系

许多免疫诊断试剂都是多组分试剂，需要仪器进行多次吸取不同试剂组分和样本，在完成最终动作之后就必须进行清洗。虽然清洗步骤可能看起来不那么重要，但它们却是至关重要的。清洗不彻底会导致高背景信号，产生“噪音”结果。另一方面，过度清洗可能使信号减弱甚至消失。

在其他方法学上，不一致的洗涤还会带来其他问题，导致实验内和实验间的差异以及结果解释上的困难。当整个板块或样品出现无法解释的变化时，可能是由于单个实验中的洗涤不一致造成的。

以96孔板式检测为例，如ELISA，在使用自动洗板机时，最好检查所有孔是否被均匀清洗。由于自动洗板机所需的细管易堵塞，因此在派发实验板之前，用一个空板检查所有孔是否均匀分配和排空。如果使用多通道移液器手动进行操作，请确保所有吸头牢固、平衡地安装，以防止洗涤液的分配和排空不均。例如，在清洗膜时，确保膜完全浸没，因为暴露部分将保持未被清洗。使用磁力搅拌器轻轻搅拌洗涤液也是一个好主意（不要过于用力，以免损坏膜），以使洗涤液在整个膜上均匀循环。

6. 使用质控品

与大多数测试一样，包括适当的质控很重要，以确定实验过程中获得的结果的有效性。不包括质控意味着无论结果看起来多么好，都是没有意义的。

阴性质控可以将无信号解释为没有目标存在，而不仅仅是检测失败。例如，在许多LFA中，即使测试带是阴性的，也会包括一个控制线以确认检测成功。同样地，阳性质控表明了目标存在于样品中的信号。

例如，在 Western Blot 检测细胞裂解液中特定蛋白时，同时进行纯化的目标蛋白样品可帮助识别背景信号中的目标带。质控品跨越目标浓度或表达水平范围也有助于解释未知样品中的水平，对定量或半定量测定特别重要。对于ELISAs，确定病人样品中某种抗体的水平是低、中还是高，有助于临床解释，并确保结果保持在检测动态范围内。

7. 考虑同时检测多个目标

在一次检测中同时检测多个目标可能是可取的。添加一个以上的目标到诊断测试中可以提高测定的可靠性、敏感性和特异性，特别是当目标可能丢失或变异到不能有效检测时。此外，宿主对抗原的反应存在自然差异，因此将不同的目标组合在一起，可以从一个样品中检测多个病原体或与之相关的免疫反应。

这些建议的目的是帮助优化免疫诊断试剂并获得最佳结果。

药驿站检测中心-抗体蛋白测序服务

药驿站检测中心基于高精度、高分辨率质谱设备，结合自主研发的测序技术平台，能够实现对抗体氨基酸序列的精准解读。同时，我们有自建的高通量表达验证平台，能够对已测得的抗体序列进行高通量表达验证，从而保证交付抗体的活性。