分子诊断试剂的研发那些事

分子诊断依靠分子生物学技术，已经成为临床医学的前沿学科，在遗传病，肿瘤等疾病诊断和治疗中发挥着越来越重要的作用。分子诊断主要检测的是核酸，包括DNA和RNA，利用核酸杂交的原理，引物和探针是其常用的工具。目前基于临床检测的技术和方法包括突变/变异检测技术、DNA测序技术、生物芯片技术、PCR技术、荧光原位杂交技术FISH，毛细管电泳和质谱分析技术。

分子诊断最常用的第一个工具是引物，引物是DNA复制的起点提供3‘-OH，由一小段单链DNA或RNA构成。自然界存在的一般是RNA片段，体外DNA复制采用人工合成的DNA引物。PCR是聚合酶链式反应，即DNA复制的过程，需要用到模板，正反向引物，酶，缓冲体系，dNTP（四种不同的脱氧核糖核苷酸），再加上一定的温控时间程序就可以完成每一次的DNA复制。

那么在PCR过程中最主要的是引物的设计，一般遵循3条原则：1、引物与模块互补；2、引物之间避免形成稳定的二聚体和发夹结构；3、尽量避免引物在模板的非特异性结合。

通常位置选择其基因组的保守区，长度由20-30个寡核苷酸组成，引物间不存在二级结构，4种碱基分布随机分布，3‘端避免出现重复的GC序列，Tm值在72℃左右，两条引物的Tm值不能差异太大，Tm=4(G+C)+2(A+T)，引物3‘-OH不能有任何修饰。

分子诊断用到的另一个常用工具是探针，它是人工设计的一段寡核苷酸，通过与目的核酸杂交来对目的核酸的识别和检测。有些探针进行了标记，如生物素，地高辛，荧光分子，辣根过氧化物酶等。探针主要有DNA探针，RNA探针，还有其他肽核酸和锁核酸探针。

探针的设计对杂交检测至关重要，影响检测特异性最重要的因素是探针的长度。探针越长，其特异性越高，但合成难度大，其成本也越高。通常有两类探针，一类是长探针，长度在500-5000bp之间，另一类是短探针，其长度小于500bp，对点突变和多态性检测比较敏感。探针标记主要有非放射性标记和放射性标记两种。

实时荧光PCR检测试剂

所谓实时荧光PCR就是动态检测在PCR过程中荧光强度的变化，获得PCR扩增的动力学曲线，借以实现对模板的定性或定量分析，其实现方式主要有两种，一种是荧光探针，另外一种是荧光染料。荧光探针的类型主要有5‘-水解探针（TaqMan探针）、分子信标、杂交探针和置换探针。荧光染料包括溴化乙锭、SYBR Green I、LC Green和SYT09。

实时荧光PCR检测实用的疾病主要包括遗传病，传染病和肿瘤。传染病也主要是在病毒性肝炎，性病和结核病，在检测方面受限于靶基因数目，在靶基因选择上就需要满足一些条件如具有高度特异性，相对序列保守性，靶基因的拷贝数因素以及形态因素等。

实时荧光PCR检测试剂研发的关键要点主要包括样品的制备，阳性对照及其类型，绝对定量和相对定量方法、实时PCR扩增体系的优化。样品制备不外乎液化，裂解和核酸回收几个步骤。阳性对照的选择需要最大限度地模仿真实样品中靶基因存在的环境和状态，且稳定，不易降解。公认的RNA阳性对照是装甲RNA，是MS2噬菌体改造而成，同样DNA阳性对照也可以制成装甲DNA，是M13噬菌体改造而成。在实时PCR中，模板定量有相对定量和绝对定量之分。绝对定量指的是获得样品中靶基因的绝对数量，如病人血清中病毒载量的检测；相对定量指的是获得样品中靶基因相对于参照样本中的靶基因的相对数量，如肿瘤样本中基因的表达水平变化。实时PCR都需要优化反应条件来提高扩增效率，可以通过调整扩增片段的长短，各组分的浓度和扩增反应的程序。

核酸杂交诊断试剂

核酸杂交技术是遗传学研究和基因诊断的常用方法。主要包括反向斑点杂交和荧光原为杂交。反向斑点杂交是先将待用探针分别交联在硝酸纤维素膜或尼龙膜上并编号，再将待测DNA样本与之杂交，由于待测DNA样本具有生物素类的标记物，结合了探针后就可以通过显色反应来反应出杂交信号了。反向斑点杂交具有可以同时检测筛查多个样本，膜条制备时间短，采用非放射性标记引物，避免同位素半衰期带来的稳定性问题等优点。常用缓存体系为柠檬酸钠缓冲液。常用添加剂，选择硫酸葡聚糖，聚乙二醇，聚丙烯钠盐，甲酰胺等作为杂交促进剂。此外探针的标记方法，杂交膜的选择，反应体系和条件的优化等在研发时应该格外注意。

荧光原位杂交技术FISH是在细胞遗传学水平上检测染色体、基因数目及结构异常的一种分子生物学技术。FISH诊断试剂研发的前提是获得理想的探针和高效的标记物，探针标记有放射性标记和非放射性标记，非放射标记又可以分为直接法和间接法，直接法利用酶促反应或化学合成将荧光素基团直接标记在核酸探针上；间接标记是先采用生物素标记的DNA探针，杂交之后用偶联有荧光素亲和素或链霉素亲和素进行检测。根据不同的临床用途FISH探针主要分为基因探针、着丝粒探针和涂染探针三类。

DNA测序检测试剂

测序技术的不断迭代更新使得测序的结果更加快速准确，Sanger法作为第一代测序技术，也称为双脱氧核糖核酸末端终止法，测序步骤包括模板分离，循环测序，测序产物纯化，毛细管电泳，数据分析等。Sanger法测序虽准确度高，但是一次测序长度仅为300-1000bp，通量低，速度慢导致第二代测序技术应运而生，采用微循环阵列合成测序法。具备低成本高通量特点，有全基因组测序，靶向重测序，ChIP测序，RNA测序，mRNA测序，总RNA测序，靶向RNA测序，小RNA测序等。目前二代测序也是目前应用最广的测序技术，随着技术的不断发展，三代单分子测序，四代纳米孔测序也在逐渐崭露头角。

目前分子诊断试剂的研制已经成为世界范围内最为活跃的创新领域之一。在研发过程中首先需要经过对诊断试剂的临床需求分析，对技术原理的理解，和体系的设计，体系的优化和性能评价最后就是试剂盒的组装和临床试验评价及注册申报等环节。