新冠核酸检测试剂盒（RT-PCR)扩增效率比对及探讨

新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第8 版）明确提出将新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测PCR法作为疑似病例诊断的金标准。目前，新型冠状病毒检测试剂种类很多，试剂的检测性能高低不一，试剂扩增效率的验证研究较少。

下面，我们就本实验室的四种核酸检测试剂盒，通过RT-PCR的CT均值，进行扩增效率的比对，并探讨其影响因素。

四种检测试剂主要组成成分

重庆中元

上海伯杰

上海之江

杭州迪安

四种检测试剂循环参数

重庆中元

上海伯杰

上海之江

杭州迪安

四种检测试剂盒及RT-PCR的CT均值

扩增比对结果

从上表看出，中元检测试剂对于ORF1ab和N序列的扩增CT均值最低，但其循环数也最少。另外三种试剂循环数相等，迪安对于ORF1ab和N序列的扩增CT均值最低，即扩增效率最高。

结果分析及影响因素探讨

2019年2月15日，CNAS-CL039《分子诊断检验程序性能验证指南》正式实施，文中对扩增效率验证进行了详细的量化描述，其判定标准为：样本和标准品的扩增效率均≥90%且≦110%。

《临床分子生物学检验》第3版介绍，聚合酶链反应受到扩增体系和扩增条件的影响[1]。

①扩增体系：即参与PCR反应的成分，主要包括模板、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶和缓冲液等。常规PCR的模板量仅需50-100ng左右，实时PCR则可降低至50ng以下，反应体系中较低量的模板有利于提高扩增产量和减少非特异性扩增。引物决定PCR扩增产物的特异性和长度，与PCR反应效果有十分密切的关系。脱氧核苷三磷酸（dNTP)即dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核苷三磷酸的混合物，反应体系4种核苷酸的含量必须一致，否则会增加反应时DNA聚合酶错配的概率。TaqDNA聚合酶缺乏3’-5’核酸外切酶活性，因此无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配，使PCR产物的序列噶生错误。错配碱基的数量受温度、Mg2+浓度和循环次数的影响，一般认为，TaqDNA聚合酶在每一次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基错配率为1/8000，因此扩增的目的基因片段越长，碱基错配的概率也越高。另外，反应体系的PH值（通常使用10-50mmol/L的Tris-HCL缓冲液）、盐的浓度等都会影响扩增的效率。

②扩增条件：即扩增的温度、时间、循环次数。退火温度取决于引物的Tm,是保证PCR扩增特异性的前提。PCR循环中每个步骤所需的时间取决于所扩增片段的长度。循环次数一般为20-45次，PCR扩增效率呈S形曲线状，平台出现的早晚与模板初始量有关，另外还与许多因素有关：如引物二聚体和反应亚产物（焦磷酸等）的产生抑制了扩增反应、反应体系中各组分的消耗和变性、引物和产物间的竞争（反应产物之间杂交，反应产物与模板的杂交甚至引物的杂交）等。

实验室要在充分考虑实际说明书的建议下，一定要进行检测系统的性能验证，尤其是低浓度。面对突发的新冠病毒疫情，不同厂家试剂质量参数难免会有各种不足，实验室根据实际工作需要选择合适的试剂，以满足急诊和常规核酸检测需求[2]。