鲎试剂法检查细菌内毒素应注意的问题播

一、鲎试剂灵敏度的复核

为了保证检查细菌内毒素结果的准确性，用于实验的鲎试剂应首先核对灵敏度。因为实际工作中，发现鲎试剂均符合药典规定标准前提下，由于生产厂家不同，部分鲎试剂的实测灵敏度与标示值有差异而导致检测同一检品时，用相同标示值的鲎试剂，出现不同结果。鲎试剂灵敏度的复核是使用该鲎试剂的前提。中国药典(2000版)在灵敏度复核项下规定,只有当实测值λc在0.5λ~2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以λ为该批试剂的灵敏度，同时要求所用鲎试剂的灵敏度须小于供试品的内毒素限值，因此灵敏度的准确与否直接关系到判断结果的正误，应尽量选用测定值与标示值一致(λc =λb)的鲎试剂。有报道，用符合药典规定的灵敏度标示值相同的鲎试剂检测同一检品，结果因鲎试剂实测值与标示值间存在差异而出现了两种完全不同的结果。因而先核对灵敏度可避免因鲎试剂本身造成的判断失误。

二、供试品的稀释

在取样品时，要熟悉中国药典的内容，不能直接取大输液原液0.1ml进行检查，这是排除干扰因素的简单有效的方法。因药典已明确规定实验中鲎试剂的灵敏度不超过0.5EU/ml，根据供试品的稀释公式:

供试品稀释倍数=L/λ

L:供试品的内毒素限量

λ:鲎试剂灵敏度的标示值(EU/ml)。

故检测大输液均应稀释后才能进行实验，如选用更高灵敏度的鲎试剂，则应增加样品的稀释倍数。稀释用的细菌内毒素检查用水药典作了规定。在4h内不得与鲎试剂产生凝集反应。如果直接用供试品原液实验，就会使供试品的内毒素要求提高到0.5EU/ml或0.5EU/ml以下，这样，根据目前大输液的生产和贮藏条件，有些就会达不到，鲎法检出的阳性率会提高，兔法复核的机遇也将增多，势必会浪费人力物力。

以前细菌内毒素的限值是按照热原检查法所需的家兔剂量计算的，由于家兔剂量往往高于人用最大剂量的几倍甚至几十倍，势必造成对产品内毒素要求过于严格，使很多合格产品被判为不合格产品或使药品生产成本增加，所以在USP和EP中，相继采用人用最大剂量来计算药品细菌内毒素的限值。如注射用头孢噻肟钠按中国药典(1995版)规定的热原剂量计算其细菌内毒素限值，与USP的限值要求相差4倍，而用最大剂量计算则两者十分接近。

三、混合液的pH值

供试液与益试剂混合液的pH值对鲎实验的影响较大，根据国内外资料的报道，实验的最适pH为6.25~7.25才能形成最佳凝胶。鲎试剂本身具有一定的缓冲能力。但pH值过大或过小均可抑制鲎试剂与细菌内毒素的反应，其原因可能是pH值过大或过小均可破坏极微量的内毒素。

四、保温温度

温度对鲎试剂的灵敏度影响很大，保温温度在25~40℃之间，随着温度的升高，鲎试剂的灵敏度亦增大，在40~46℃之间，温度对益试剂的灵敏度无明显影响，达到49℃或更高温度时，则会破坏鲎试剂。故应严格按照药典的要求，温度控制在(37士1)℃之间，才可获得理想的结果。

五、振动的影响

鲎试剂与细菌内毒素形成的凝胶受到振动后易变形而误判为阴性。因此，在鲎实验过程中，不宜进行容易引起试管振动的实验操作，实验用的试管架的眼孔直径应与安瓿或试管直径相接近，避免安瓿或试管左右晃动。水浴箱要放置在固定不易受到振动的地方，保温过程中不可随时取出观察。

六、所用器皿的影响

所用器皿均应彻底洗净和灭菌，实验用器皿均应充分洗涤并冲洗干净，特别是接触酸碱或用洗衣粉、洗液等洗涤后，更应冲洗干净，以免残留物破坏极微量的内毒素。灭菌应按药典中的有关方法处理，防止引入外源性内毒素。如有条件的话可用合格的细菌内毒素快检盒。

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本文节选自：《细菌内毒素检测中问题的研究》，文章作者：岳丽娜。如有侵权，请联系删除，谢谢！