分子诊断(NGS)标准品构建

肿瘤个体化治疗以疾病靶点基因诊断信息为基础，以循证医学研究结果为依据，为患者提供接受正确治疗方案的依据，已经成为现代医学发展的趋势。临床研究证实，通过检测肿瘤患者Th物样本中Th物标志物的基因突变、基因SNP分型、基因及其蛋白表达状态来预测药物疗效和评价预后，指导临床个体化治疗，能够提高疗效，减轻不良反应，促进医疗资源的合理利用。

个体化医学检测应用技术包括Sanger测序法、焦磷酸测序法（Pyrosequencing）、新一代测序（NGS）、扩增阻滞突变系统（ARMS）-PCR法、高分辨率熔解曲线（HRM）法、数字PCR（DigitalPCR）、荧光原位杂交（FISH）、免疫组化（IHC）、荧光定量逆转录PCR(Q-RT-PCR)等。

NGS在分子诊断中的应用

（1）产前筛查和产前诊断：靶向区域基因组测序、大范围基因组测序、染色体非整倍性检测

（2）遗传病诊断

（3）肿瘤诊断与治疗

（4）植入前胚胎遗传学诊断

（5）病原微Th物检测

……

什么是分子诊断的标准品

根据《体外诊断试剂注册管理办法》（试行），体外诊断试剂可分为I类、II类、III类，其中II类、III类要求进行性能验证，国内现有的个体户诊断项目绝大多数属于此类。

性能验证的内容包括：精密度或重复性（定性和定量）、准确度（定性为方法学比较或与标准样品盘比较）、线性（定量）、可报告范围（定量）、检出限（定性）、参考区间（定量）、抗干扰能力等。

涉及人基因组的检验项目包含如下质控品：

阴性质控品：判断假阳性反应

阳性质控品：判断假阴性反应

提取内对照：监测提取效率是否符合要求

扩增内对照：监测扩增效率是否符合要求

什么时候需要使用诊断标准品

· 免疫组织化学参考品

· 融合基因参考品（DNA层面、RNA层面、蛋白层面）

· 基因重排参考品（DNA层面、RNA层面、蛋白层面）

· 基因突变参考品（SNV、Indel）

· CNV参考品

· 低甲基化水平参考品

· 基因组不稳定参考品

NGS标准品构建的思考维度

（1）表征问题：标准品是否具有代表性，如何更具有代表性

（2）稳定性问题：是否满足批次内和批次间稳定性需求

（3）来源问题：获取途径的稳定性、可追溯性、可控性及可操作性

（4）成本问题：成本的可控性

NGS标准品的分类与特点

（1）原始材料来源：临床样品；原始细胞株

（2）基因修饰材料来源

（3）不同标准品模型之间的比较

NGS标准品的模型构建

(1）随机修饰：VIRUS-FreeTM基因导入系统

优势：流程短，无需病毒包装；插入片段大小不受限制；表型稳定

劣势：需要高效的转导方式

案例：人结直肠癌细胞HCT116/GFP稳转细胞株

转染24h 药筛3天后的荧光图片

（2）定点修饰：基于CRISPR介导的基因编辑技术；适用于基因的定点缺失Del、定点插入Ins、定点突变SNV、拷贝数变异CNV和基因重排等。

案例：293T细胞EGFR基因V769_D770insASV点突变

定点突变方案：通过CRISPR介导的同源重组技术进行定点突变p.V769_D770insASV (c. 2307_2308 ins GCCAGCGTG)

提升标准品模型质量的思路与策略

（1）混合克隆单克隆

（2）高代次细胞株低代次细胞株

（3）病毒法VIRUS-FreeTM基因导入系统

（4）随机插入定点修饰

（5）单独构建All in one

海星生物Hycyte基因检测标准品特点

可再生

有类似检测样本的基因组复杂结构（异质性）

有明确的拷贝数和等位基因数

质量高度稳定、均一性好

具有临床标本和肿瘤细胞的特性

无伦理风险

海星生物专注细胞基因编辑（基因敲除\敲入\突变\过表达）十年：为基因检测提供参考品细胞株开发，已经和多家基因诊断公司建立合作。海星生物可以提供诊断试剂盒标准品定制化服务，为客户定制拷贝数固定（或高突变频率）的单核苷酸变异（SNV）、碱基缺失（Deletion）、碱基插入（Insertion）、基因融合（Fusion）、拷贝数变异（CNV）等各种变异类型的标准品细胞株，可应用于基因检测的上游试剂盒研发、企业参考盘注册申报、生产质检，下游ICL的日常质控、EQA支持。解决临床样本有限，稀有突变难获得的问题。还可以订制开发IHC（免疫组化）标准品细胞株，解决细胞系表达丰度不稳定，染色深浅不一的问题。此外针对肿瘤早筛甲基化检测试剂盒，海星生物可以提供低甲基化水平DNA参考物质。