大规模新冠核酸筛查中出现的异常扩增曲线分析

单位：1.湖南省脑科医院；2.中南大学湘雅二医院

2019年12月底新冠疫情暴发，新冠核酸检测逐渐与我们的学习、工作、生活息息相关、密不可分。进入2022年，奥密克戎变异毒株出现，全球进入新一轮新冠疫情危急时刻。笔者随湖南省支援吉林核酸检测队结束在长春气膜实验室的40天核酸检测工作。

在新冠核酸扩增结果判读过程中，我们会遇见各式各样的异常曲线。本文就2022年3-4月吉林长春体育中心气膜实验室所遇见的异常曲线，做一个经验分享与探讨。

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前 言

随着国内新冠肺炎疫情防控措施的加大，常态化核酸检测筛查力度和检测范围的持续加强，现已建立了大量专业的PCR实验室、储备了大量专业的核酸检测人员用于新冠疫情的防控。实时荧光定量PCR技术的基本原理也已被核酸检测工作者所熟知。然而，在第一次进入气膜实验室工作之前也应当做好充足的功课。

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熟悉所用仪器的性能

在大规模筛查期间，临时组建的气膜实验室的仪器来源可能由多家实验室提供，可能品牌多样，应熟悉每一款仪器的性能。了解每款PCR仪的荧光通道，使用的光源，采光方式，降温速度，软件操作等。

本次长春气膜实验室使用了3个品牌仪器，其中2个品牌PCR仪为侧壁采光，故必须保证管壁透明，管盖形状（平盖、圆盖、凸盖）及透光度（透光、磨砂）均可用，也可在管盖做标记，不影响荧光采集及最后结果判读。有1个品牌的PCR仪为顶部采光，故必须保证管盖透明。而本次长春气膜实验室使用了透明封口膜，随着PCR反应的进行，封口膜会因受热形成凸起，会影响仪器采光。

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分析所选试剂的特点

气膜实验室可能同时备有多品牌的核酸检测试剂，有主检测试剂及高灵敏度的复查试剂。了解每个品牌试剂检测所使用的荧光探针及其对应标记的靶基因，扩增程序，扩增试剂组成及分样量，核酸加样量等。

本次使用2个品牌试剂，作为常规筛查试剂的品牌1为42个循环，但前10个循环没有收集荧光，后32个循环采集荧光，故其实验结果Ct值≤32。作为复查试剂的品牌2为45个循环，从第一个循环即开始采集荧光，故其实验结果Ct值≤45，且其核酸加样量为20微升，提高了检测灵敏度。但如若未充分混匀会造成荧光曲线异常。

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了解不同品牌仪器及试剂组合的扩增时间

因仪器的性能不同，同一品牌扩增试剂在不同仪器的扩增时间会有差异。了解扩增时间，有利于大规模筛查时的时间调控及仪器分配，有利于提高效率。

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异常曲线分析

在吉林长春气膜实验室工作的40天，笔者现将核酸检测过程中碰到的异常曲线进行分析，如有描述或者解释不当之处，敬请各位同仁指正。

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直线斜飘型

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曲线特点：

曲线无典型“S”型扩增，呈现为斜直上飘的特点。

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原因分析：

该类型曲线反应孔多数会出现液面偏低情况，可能是扩增试剂分液不准确，或反应孔气密性差，反应过程中溶液蒸发引起探针浓度增加。

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解决方案：

配置试剂时注意检查试剂液面，核酸加样后用力压实封好反应板，上机扩增前再次检查有无缝隙。

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倒“S”型

原始曲线图：

基线调整后曲线图：

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曲线特点：

曲线如倾倒的“S”型，呈现先下降再上升后下降的特点，形似光滑的波浪状。

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原因分析：

仪器的自动基线设定为6-12循环，因样本病毒核酸载量高，扩增曲线起跳早，位于或早于基线循环处，导致曲线异常。

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解决方案：

该类型曲线需手动调整基线范围，将基线设定前移至合适循环，重新分析。

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小“S”型

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曲线特点：

曲线呈现出不典型的“S”型，有极短的对数扩增上升期，后进入平台期，荧光强度高于阈值，但远低于正常扩增曲线荧光强度，多见于顶部采光的PCR仪。